細胞ELISPOT檢測

1．培養板的預處理：在24孔培養板內加0.5ml 0.2%戊er醛，37℃，4h，棄掉板中的處理液，用PBS洗滌3次，每次3min；

2．抗原包被：將適量抗原溶于包被緩沖液中，每孔加入0.5ml，4℃過夜，PBS-T洗滌3次，每次3min；

3．制備細胞懸液：將待測已致敏小鼠處死，取出pi臟，置于加有Hanks液的平皿內，用鈍頭直角9號zhu射器針頭破少許脾被膜后，趕出細胞，用毛細吸管輕輕吹散細胞團后，將懸液通過250目尼龍網，取濾液，1000r/min離心5min，Hanks液洗滌3次，計數細胞后，用1640液重新懸浮細胞，配成所需濃度；細胞實驗部分設備圖片公司目前擁有多項專利產品及技術，其中發明專利兩項，軟件著作權八項，實用新型專利三項，商標兩件。

4．往各孔中加入0.5ml含不同濃度（104-106/ml）的細胞懸液，置37℃，5％CO2條件下孵育2-4h，棄掉培養液，PBS-T洗滌3次，每次3min；

5．往各孔中加入0.5ml生物素化抗ti（Bio-Ab）（2μg/ml），37℃孵育1h或4℃過夜，棄掉液體，PBS-T洗滌3次，每次3min；

6．加入辣根過氧化物酶結合的親合素（Avi-HRP）（2μg/ml），37℃孵育30min，棄掉液體，PBS-T洗滌3次，每次3min；

7．配制明膠-底物液：在37℃水浴中，將2.5mlTMB溶液（4mg/ml jia醇溶液）滴加入7.5ml10%明膠溶液（用pH5.0磷酸鈉-檸檬酸緩沖液配制）邊加邊攪，溶液呈白色，加入14μl 3% H202；

8．顯色與計數：將培養板底冰浴，每孔加入0.6ml明膠-底物液，約3min，混合液凝固，將培養板取出，置室溫5min，將板倒置，用肉眼和低倍放大鏡計數所顯示出的顏色的斑點。

細胞傳代培養

操作步驟

1.將長滿細胞的培養瓶中原來的培養液棄去。

2、加入0.5- -1ml 0.25%胰酶溶液，使瓶底細胞都浸入溶液中。

3、瓶口塞好橡皮塞，放在倒置鏡下觀察細胞。觀察消化也可以用肉眼，當見到瓶底發白并出現細zhen孔空隙時終止消化。隨著時間的推移，原貼壁的細胞逐漸趨于圓形，在還未漂起時將胰酶棄去，加入10m培養液終止消化。觀察消化也可以用肉眼，當見到瓶底發白并出現細zhen孔空隙時終止消化。一般室溫消化時間約為1- -3分鐘。

4、用吸管將貼壁的細胞吹打成懸液，分到另外兩到三瓶中，實踐培養液塞好橡皮塞，置37°C下繼續培養。第二天觀察貼壁生長情況。

附:消化液配制方法:

稱取0.25克胰酶蛋白酶(活力為1 : 250)， 加入100ml無Ca2+、Mg2+的Hank's液溶解，濾器過濾chu菌，4°C保存,用前可在379C下回溫。胰酶溶液中也可加入EDTA，使zui終濃度達0.02%。

雜交瘤細胞基因測序

雜交瘤細胞有丟失高特異性高活性的風險，或者細胞狀態不好乃至。BrdU染色原理BrdU(5-脫氧尿核苷)是胸腺的衍生物，常用于標記中新合成的DNA,可代替胸腺選擇性整合到細胞中新合成的DNA中(細胞周期S期)。而經過雜交瘤測序，可以獲得相應的序列，可以以重組蛋白的方式來穩定獲得；從而使得研發或生產者不必以雜交瘤細胞為載體保留該，而可以以堿基序列的形式進行保存和傳播交流、鑒定。同時還可以使用獲得的測序結果進行等知識產權方面的申請審批。有時為了進一步大規模生產或進行人源化等生物工程操作/修飾，有必要了解雜交瘤所表達的對應的基因序列以進一步進行生物工程操作與生產。

相較于直接對進行基于蛋白質分析的測序相比，得益于基因測序技術的發展，雜交瘤測序可以提供的結果，防止蛋白測序中如亮氨酸/異亮氨酸較難區分等潛在風險。

大鼠脂肪的分離

將手術切取的大鼠脂肪組織盡量剪碎后移至離心管，其余步驟與人脂肪的分離一致。

經手術切除獲得的大鼠皮下脂肪組織消化后原代培養24 h，且肉眼觀察會發現培養瓶底部貼附著一層網狀薄膜，輕輕搖晃培養瓶可使這層網狀薄膜從瓶壁上脫落，鏡下觀 察發現大部分細胞都附著于這層膜上，通過術獲取的人脂肪組織消化后則無此現象。共培養-定時間后進行破骨細胞抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistantacidphosphatase,TRAP染色鑒定和骨吸收功能檢測，并進一步采用RT-PCR對破骨細胞標志酶基因基質金屬蛋白酶。增加膠原酶的量和消化時間也無法避免，取材時的或脂肪間結締組織未被完全消化，穿過細胞篩進入了培養瓶并沉淀于瓶底部形成的。膠原蛋白酶雖然可以特異性水解膠原蛋白的三維螺旋結構，但不會損傷其他蛋白質。處理方法是37 ℃下用胰蛋白酶 消化5 min。然后利用40 μm的細胞篩過濾后傳代。 根據作者的經驗，每毫升手術切除的大鼠脂肪可分離基質血管成分細胞約1.81×106個。原代培養2.24×10^7個大鼠基質血管成分細胞，40 h后傳代時約剩余 6.2×10^6個細胞，細胞剩余率27%。