蛋白提取

大部分蛋白質(zhì)都可溶于水、稀鹽、稀酸或堿溶液, 少數(shù)與脂類結(jié)合的蛋白質(zhì)則溶于乙醇、丁醇等有ji溶劑中，因些，可 采用不同溶劑提取分離和純化蛋白質(zhì)及酶。

(一)水溶液提取法

稀鹽和緩沖系統(tǒng)的水溶液對蛋白質(zhì)穩(wěn)定性好、溶解度大、是提取蛋白質(zhì)常用的溶劑,通常用量是原材料體積的1-5倍,提取時需要均勻的攪拌,以利于蛋白質(zhì)的溶解。提取的溫度要視有效成份性質(zhì)而定。ELISA是一種結(jié)合抗原、抗ti特異性反應(yīng)和酶對底物高xiao催化作用的高敏感性免yi學(xué)實驗技術(shù)。一方面，多數(shù)蛋白質(zhì)的溶解度隨著溫度的升高而增大，因此，溫度高利于溶 解，縮短提取時間。但另一方面. ,溫度升高會使蛋白質(zhì)變性失活,因此，基于這一點考慮提取蛋白質(zhì)和酶時一般采用低溫( 5度以下)操作。為了避免蛋白質(zhì)提以過程中的降解，可加入蛋白 水解酶抑zhi劑(如二yi丙基氟磷酸,碘yi酸等)。

染色質(zhì)免l疫共沉淀技術(shù)(ChIP)

基于體內(nèi)分析而發(fā)展的染色質(zhì)免l疫沉淀分析Chr omat in immunoprecipitat ionassay kit, ChIP)技術(shù)可以真實、完整地反映結(jié)合在DNA序列上的調(diào)控蛋白。由于ChIP采用甲醛固定活l細(xì)胞或者組織的方法，因此能比較真實的反映細(xì)胞內(nèi)TF與Promoter的結(jié)合情況，還可以用來研究組蛋白的各種共價修飾與基因表達(dá)的關(guān)系。此外，Illumina還捕獲了未翻譯的區(qū)域，這是NimbleGen和安捷倫平臺無法靶定的。近年來,這種技術(shù)得到不斷的發(fā)展和完善。采用結(jié)合微陣列技術(shù)在染色體基因表達(dá)調(diào)控區(qū)域檢查染色體活性,是深入分析癌l癥、心血l管病以及中央神經(jīng)系統(tǒng)紊亂等疾病主要通路的一-種非常有效的工具。

染色質(zhì)免l疫沉淀分析(ChIP) 的基本原理是在活l細(xì)胞狀態(tài)下，當(dāng)用甲醛處理時，相互靠近的蛋白與蛋白、蛋白與核酸(DNA或RNA)之間會產(chǎn)生共價鍵。細(xì)胞內(nèi)，當(dāng)F與Promoter相互結(jié)合時，它們必然靠的比較近或者契合在一起，這個時候用甲醛處理，能使它們之間產(chǎn)生共價鍵。有絲分裂過程中DNA鏈之間的錯配引起的fu制滑動被認(rèn)為是導(dǎo)致STR產(chǎn)生的較為常見原因，并且依據(jù)不同fu制單元大小的不同以及不同物種之間，fu制滑動發(fā)生的概率也不相同。固定的蛋白質(zhì)DNA復(fù)合物通過超聲或酶處理將其隨機(jī)切斷為-定長度范圍內(nèi)的染色質(zhì)小片段然后通過抗原抗l體的特異性識別反應(yīng)沉淀此復(fù)合體，特異性地富集目的蛋白結(jié)合的DNAl片段，通過對目的片斷的純化與檢測，從而獲得蛋白質(zhì)與DNA相互作用的信息。通過qPCR或二代測序，篩選與目的蛋白互作的未知DNA信息。

RIP

技術(shù)概述

RIP是研究體內(nèi)蛋白與RNA互作的重要技術(shù)。在同樣獲得80M測序數(shù)據(jù)的情況下，NimbleGen有97%的目標(biāo)序列達(dá)到10x以上的測序深度，而其他產(chǎn)品只有90%。該技術(shù)先用甲醛等試劑交聯(lián)細(xì)胞內(nèi)的“蛋白-RNA”互作復(fù)合物，裂解細(xì)胞后，用靶蛋白特異的抗l體(或標(biāo)簽抗l體)做免l疫沉淀，獲得“靶蛋白-RNA”互作復(fù)合物，去交聯(lián)分離其中的RNA;針對預(yù)測的靶蛋白結(jié)合RNA的序列設(shè)計引物，

做qPCR實驗，驗證預(yù)測的RNA是否與靶蛋白有結(jié)合，或者將分離出來的RNA做高通量測序，篩選到可能與靶蛋白結(jié)合的RNA。

技術(shù)流程

細(xì)胞交聯(lián)-→細(xì)胞裂解-→免l疫共沉淀→去交聯(lián)→RNA分離→建庫→高通量測序(或qPCR)。

18.引物是經(jīng)過PAGE純化的，為什么還有堿基缺失或插入？

答：理論上分析型PAGE變性電泳，可以區(qū)分引物之間一個堿基的差別。但是制備PAGE電泳，上樣量都是非常大，電泳時的條帶非常寬，帶與帶之間有重疊，分辨率已下降，電泳后割帶回收目的引物時，很難說不割到差別僅幾個堿基的引物。隨后設(shè)計BSP引物進(jìn)行PCR，在擴(kuò)增過程中尿嘧定全部轉(zhuǎn)化為胸腺嘧定，zui后對PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序就可以判斷CpG位點是否發(fā)生jia基化，稱為BSP-直接測序法。國內(nèi)有一個不好的現(xiàn)象，PAGE純化的引物，特別是長引物要的量都比較高，導(dǎo)致割的條帶有時可能比較寬。建議：您如果減少OD數(shù)，引物遇到的問題可能就會少一些。

19. TaqMan 探針設(shè)計的基本原則是什么？

答：下列原則供您參考。

◆TaqMan 探針位置盡可能靠近擴(kuò)增引物（擴(kuò)增產(chǎn)物50-150bp），但不能與引物重疊。

◆長度一般為18-40mer 。

◆G-C含量控制在40-80%左右。

◆避免連續(xù)相同堿基的出現(xiàn)，特別是要避免GGGG或更多G出現(xiàn)。

◆在引物的5'端避免使用G。

◆選用比較多的堿基C。

◆退火溫度Tm控制在 68-70C 左右。

有用的熒光染料參數(shù)